En Sevilla ejerció la profesión de médico con gran éxito, desde 1534 sabemos que estuvo ejerciendo con el médico Pérez de Morales, quien tenía una afamada y numerosa clientela que herederá pues además se casa con su hija, Catalina de Morales, con la que tendrá siete hijos, pero su fama le llega gracias a un herbolario que cultivó en su propia casa, allí reunió plantas americanas desconocidas en Europa, y se dedicó a su estudio. Ejerció de comerciante de medicinas e incluso participó en el tráfico de esclavos.
A raiz de sus estudios publicó el libro "Historia medicinal de las cosas que se traen de nuestras Indias Occidentales", que fue publicado como trilogía en 1565, 1569 y 1574, tratado que fue traducido al latín y al inglés, debido a la expectación que originó.
Monardes aprovechó que Sevilla era el punto de entrada del comercio con las Indias, haciendo acopio de las nuevas plantas que llevaban al continente. Tuvo conciencia del extraordinario interés de los productos medicinales que llegaban del Nuevo mundo. Se propuso estudiarlos con detenimiento y experimentar con ellos, ya que su situación era privilegiada, Estudio en su huerto, en la calle Sierpes 9, las propiedades de una importante cantidad de plantas, haciendo hincapie en sus propiedades farmacológicas. Estudió y catalogó el Cardo, la pimienta, la canela, el tabaco. Sus estudios dieron a conocer al europeo plantas como la piña tropical, el cacahuete, la batata, y muchas otras.
Sus obras despertaron un inusitado interés pues descubrían plantas y propiedades que para el europeo eran novedosas, de la importancia de sus estudios basta decir que llegaron a traducirse a seis idiomas y contaron con más de cuarenta ediciones. Su contribución a la farmacognosia fue muy relevante, dejó atrás el concepto de los herbarios tradicionales para ahondar en el origen, y caracteres de identificación, además de los usos de los materiales americanos, apuntando la similitud y diferencias con los productos de la farmacia clásica.
Amén de sus estudios antes citados, Monardes publicó otros trabajos, examinó el humanismo y aconsejaba el estudio de los clásicos en su lengua original, el griego, en su obra Pharmacodilosis (1536); En "De Seanda vena in Pleuriti Inter Grecos et Arabes Concordia" del año 1539 hacía mención a la importancia del griego y el árabe en la medicina, eran conocidos entonces los grandes avances que los árabes habián realizado en los estudios médicos, por lo que para Monardes era importante conocer el idima para no tener que leer traducciones de sus manuales, los cuales perdían su esencia al no ser estudiados en su lengua original. Escribió tambien un libro dedicado a las rosas y los cítricos (De Rosa et partibus eius (1540), otro a la nieve (1571) y otro al hierro (Dialogo del hierro, 1574).
Fue el primer autor conocido en informar y describir el fenómeno de la Fluorescencia, entonces desconocido, en su libro Historia Medicinal (Sevilla, 1565), donde describe el extraño comportamiento de ciertas infusiones de Lignum nephriticum.
Entre 1580 y 1582 el Cabildo hispalense lo requiere para el control de la epidemia de peste que asola la ciudad y escribe unas Epístolas sobre medidas y medicamentos a emplear.
Murió el 10 de Octubre de 1588 en Sevilla. Está enterrado en el Convento de San Leandro, en cuya iglesia hay una lápida que lo recuerda.
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